7.cv_Cytogenetické metódy
7.cv_Cytogenetické metódy
Cytogenetika
- zaoberá sa genetickými javmi na bunkovej a jadrovej úrovni
- podstatou je chromozómová analýza
o počet a tvar chomozómov
o segregácia počas mitózy a meiózy
o vzťah chromoz. poškodení a fenotypu
Chromozóm
- nukleohistónový komplex
- kladne nabité históny sa viažu k negatívne nabitej molekule DNA ( nukleozóm)
- špiralizované usporiadanie nukleozómov sa nazýva solenoid
- z neho vzniká chromatínové vlákno
Heterochromatín
- neaktívny chromatín
- kondenzované chromatínové slučky
- intenzívne sa farbí
- gény sa neprepisujú
- konštitutívny heterochromatín je trvalo neaktívny
- fakultatívny heterochromatín sa môže zmeniť na aktívny euchromatín
Euchromatín
- dekondenzovaný
- slabo sa farbí
- gény sa prepisujú do RNA
Morfológia chromozómu
- Teloméra
- Centroméra
- Chromatidy
o krátke (p-)rameno
o dlhé (q-) rameno
Typy chromozómov
- metacentrický
- submetacentrický
- akrocentrický
- telocentrický ( u ľudí neni)
Chromozomálna sústava
- haploidný počet- základný počet kvalitatívne odlišných chromozómov ( pohl.bunky)- len jedna sada, chromozóm nemá homologický pár
- diploidný počet- dvojnásobok základného počtu- somatické b.
- kolísanie sústavy- obligátne (n, 2n,pohlavie) a fakultatívne (genómové a chromozómové aberácie)
Karyotyp
- diploidný súbor chrom. zoradený do homologických párov a definovaný podľa veľkosti, tvaru a počtu
Idiogram
- schematické znázornenie chromozomálnej sústavy s vyznačením veľkosti a typu chromozómu, polohy centroméry a iných zvláštnych štruktúr
Princíp cytogenetického vyšetrenia
- porovnanie karyotypu jedinca v ideálnom stave s karyotypom vyšetrovaného jedinca
Konštrukcia karyotypu
- chromozómy v metafáze mitotického delenia
- kultivácia buniek in vitro
- stimulácia mitózy
- blokovanie mitózy v metafáze
- sušenie bunkovej suspenzie
- fixovanie a farbenie chromozómov
- fotografovanie, vystrihnutie a usporiadanie chromozómov
Metódy zostavovanie karyotypov
- konvenčná- hospodárske zvieratá- rozdelenie chromozómov do 4 skupín podľa polohy centroméry
- v rámci skupiny usporiadanie podľa veľkosti
- Denverská- človek
o A- najväčšie metacentrické ( 3 páry)
o B- najväčšie submetacentrické (2 páry)
o C- stredné submetacentrické ( 7 párov)
o D- akrocentrické ( 3páry)
o E- malé submetacentrické ( 3páry)
o F- najmenšie metacentrické (2páry)
o G- dva akrocentrické
o pohlavné
Farbenie karyotypu
- celoplošné
- selektívne- farbenie koncových častí ( identifikácia zlomov a strát koncových úsekov), chromatid ( identifikácia blokovanie crossing overov) alebo centromér
Prúžkovacie metódy
- rozdielna reakcia heterochromatínu a euchromatínu na zásadité farbivá
- chromozómy rozdelené na prúžky
- poloha a počet prúžkov charakteristická pre konkrétny chromozóm konkrétneho druhu ( G,R,Q,C banding)
Fish
- fluorescenčná in situ hybridizácia
- sonda- jednoreťazová DNA značená fluorescenčne, komplementárna k určitej oblasti chromozómu
- význam- stanovenie poradia génov na chromozóme, detekcia chýbajúcich úsekov DNA
Molekulárno- genetické metódy
- metódy založené na rozdielnej migrácii v jednotlivých alel pri ELFO
- metódy založené na špecifickom štiepení
- sekvenovanie DNA
PCR- polymerázová režazová reakcia
- po izolácii genómovej DNA umožňuje efektívne namnoženie špecifických úsekov DNA ohraničených dvomi oligonukleotidovými primermi v podmienkach in vitro
- cyklicky sa opakú tri základné kroky ( 20 – 40 x)
- počet kópií rastie exponenciálne
postup
- denaturácia: zohriatím reakčnej zmesi na teplotu
- anelácia primerov na templátovú DNA: zníženie teploty na 40- 60, PCR primery sú navzájom vzdialené 100- 5000 bp a orientované na protiľahlé DNA templátové vlákna
- polymerizácia: účinkom DNA polymerázy sa syntetizuje druhé vlákno DNA pripájaním nukleotidov na 3´OH koniec primerov, optimálna teplota reakcie je
komponenty nevyhnutné pre PCR
- superčistá voda
- Taq polymeráza
- dNTP
- primery
- MgCl2
- PCR pufor
Faktory ovplyvňujúce PCR
- špecifita
o schopnosť amplifikovať len úseky s presnou homológiou sekvencií v oblasti primerov
o nižšie anelačné teploty a vyššia koncentrácia Mg2+ spravidla špecifitu znižujú, takže dochádza k amplifikácii tzv, nešpecifických fragmentov
- citlivosť
o počet kópií templátu, ktoré je možné dokázať metódou PCR
o teoreticky možno amplifikovať aj jednu jedinú kópiu, prakticky je to číslo vyššie, takže citlivosť je nižšia
- efektívnosť
o aké množstvo molekúl templátu sa kopíruje v jednotlivom cykle
o Teoreticky sa kopírujú všetky molekuly, prakticky je toto množstvo nižšie
- fidelita
o miera presnosti sekvencie PCR produktu v porovnaní s templátom, t.j. do akej mieri je výsledný PCR produkt ( DNA fragment) sekvenčne identický s ,,originálom,,- pôvodným templátom
o závisí hlavne od chybovosti enzýmu a pomeru jednotlivých dNTP
o je to nepriamo úmerná počtu zle inkorporovaných- mutovaných nukleotidov
Primery
- primery použité v jednej PCR reakcií ( primerový pár) musia mať približne rovnakú teplotu topenia (Tm- teplota, pri kt.je ½ primerov prítomná v 1vláknovej forme, anelačná teplota je o 5C nižšia ako Tm)
- doporučená hodnota obsahu GC párov je v rozmedzí 40- 60%
- rovnomerné rozmiestnenie nukleotidov ( tzn. nemali by byť 4 rovnaké nukleotidy za sebou)
- sekvencia primerov musá byť jedinečná, aby nasadli len na špecifické miesto na templátovej NDA, pričom špecifita primeru je ovplyvnená predovšetkým sekvenciou na 3´- konci ( na 5´konci môže obsahovať nekomplementárne sekvencie)
- do mastermixu pridávať primery v rovnakej koncentrácii
Typy PCR
- hotstar PCR
o reakcia využívajúca rekombíinantný enzým DNA polymerázy, ktorý na iniciáciu polymerizácie vyžaduje vysokú aktivačnú teplotu (cca95C) pred zahájením 1.cyklu- znižuje tvorbu nešpecifických produktov za nízkych teplôt ( počas prípravy mastermixu)
- touchdown PCR
o počiatočné cykly majú vysokú anelačnú teplotu, ktorá sa postupne v ďaôších cykloch znižuje- vysoká teplota zabráni nešpecifickým väzbám primerov s templátovou DNA a neskoršia nižšia teplota namnoží už lne špecifické PCR produkty
- nested PCR
o dvojkroková PCR reakcia
o 1.krok: amplifikuje sa dlhší DNA fragment pomocou jednej sady primerov
o 2. krok: druhá sada primerov amplifikuje špecifický vnútorný DNA fragment, pričom ako templát je použitá vzorka z 1. PCR reakcie- zvyšuje sa špecifickosť a citlivosť diagnostických PCR reakcií
- multiplex PCR
o v jednej reakčnej zmesi je viac primerových párov, takže prebieha maplifikácia viacerých úsekov DNA v rovnakom čase- urýchľuje celkový čas analýzy a znižuje celkové použité financie
- real- time PCR ( kvantitatívna PCR)
o najprv sa použie RNA
o po každom cykle sa spektrofotometricky meria množstvo DNA- zistenie množstva pôvodnej templátovej DNA vo vzorke dvojkroková procedúra na amplifikáciu PCR produktu z izolovanej mRNA
o 1. krok: mRNA sa prepíše reverznou tranksiptázou využitím dNTP do jednovláknovej DNA
o 2. krok: nasleduje štandardná PCR reakcia na amplifikáciu DNA- detekcia exprimujúcej sa DNA vo vzorkách
- alelovo- špecifická PCR
o používajú sa primery s odlišnou sekvenciou na 3´konjcoch a maximálna špecifita PCR reakcia, reakcia neprebehne, ak miesto na templátovej DNA nie je komplementárne k 3´koncu primeru
o detekcia konkrétnych mutácií v prípade genetických ochorení
- mutagenéza prostredníctvom PCR
o na amplifikáciu sa používajú dlhé primery, ktoré majú cielene mutovaný nukleotid v strednej časti- mutácia v strede primeru neovplyvní aneláciu s templátovou DNA, pričom výsledkom je tvorba PCR produktu s mutovanou sekvenciou DNA
Metódy založené na PCR
- RFLP ( polymorfizmus dĺžky restričkných fragmentov)- špecifické štiepenie genómovej DNA restrikčnou endonukleázou
- po separácii na agarózovóm alebo polyakryamidovom géli je možné odčítať prítomnosť mutácie, alebo polymorfizmu
SSCP
- jednovláknový konformačný polymorfizmus
- princípom je schopnosť NDA zaujať po denaturácii špecifickú priestorovú konformáciu
RAPD
- rýchla detekcia polymorfizmu v genóme, založená na amplifikácií oblasti genómu použitím krátkych primerov ( 10- 12 nukleotidov) náhodnej sekvencie
- využiteľná na rôzne aplikácie ako je mapovanie génov, detekcia diverzity reťazca DNA, analýza taxonomických vzťahov
Ďalšie metódy
- AFLP, DGGE, sekvenovanie, HRM
ELFO
- elektroforéza
- využíva schopnosť NK putovať ku kladne nabitému pólu
- prebieha v elektroforetickej aparatúre v gélovitých roztokoch, ktoré vytvárajú sieťovitú štruktúru, čím separujú molekuly odlišujúce sa tvarom a veľkosťou
Rýchlosť pohybu NK v géli závisí od
- veľkosti NK
- hustoty gélu
- napätie ELFO aparatúry